Nafsiah Mboi merupakan putri sulung dari 6 bersaudara. Ayah Nafsiah adalah hakim yang pernah bertugas di Makassar, Surabaya, Jayapura, dan Jakarta serta merupakan tokoh masyarakat dan intelektual di Sulawesi Selatan. Nafsiah memiliki saudara kandung bernama Prof. Dr. Andi Hasan Walinono, Direktur Jenderal dan Sekjen Departemen Pendidikan dan Kebudayaan pada era 1980-an, dan Erna Witoelar, aktivis lingkungan yang juga mantan Menteri Permukiman dan Pengembangan Wilayah pada Kabinet Persatuan Nasional era Presiden Abdurrahman Wahid. Suaminya, dr. Aloysius Benedictus Mboi atau kerap dipanggil Ben Mboi sempat menjabat sebagai Gubernur Nusa Tenggara Timur (NTT) periode 1978-1988. Keduanya bertemu di kampus FK UI, setelah Nafsiah lulus pada tahun 1964, mereka menikah dan dikaruniai 3 orang anak. Sepak terjang Nafsiah di bidang kesehatan dimulai sejak tahun 1978, ketika ia bahu - membahu dengan sang suami dalam mengangkat derajat kesehatan dan kesejahteraan masyarakat NTT yang saat itu merupakan propinsi tertinggal di Indonesia. Karena dedikasinya pasangan tersebut menerima banyak penghargaan. Ia juga dikenal aktif di bidang HAM dan pernah menjadi ketua komite hak-hak anak untuk PBB. Nafsiah juga dikenal memiliki kepedulian yang tinggi di bidang advokasi HIV/AIDS. Nafsiah dikatakan turut mempelopori lahirnya Komitmen Sentani pada tahun 2004 yang menjadi tonggak komitmen pemerintah pusat dan daerah untuk penanggulangan AIDS. Pada tanggal 13 Juni 2012, Nafsiah diangkat menjadi Menteri Kesehatan oleh Presiden Susilo Bambang Yudhoyono setelah menteri sebelumnya, Endang Rahayu Sedyaningsih meninggal pada 2 Mei 2012 karena sakit kanker paru-paru.